从Barrett化生到食管腺癌：分子背景
2016-04-08 09:53 来源： 作者：
翻译/校译 王 晔
北京大学第三医院消化科
Barrett食管是EAC最重要的癌前病变，这一点已经得到广泛的证明。Barrett食管是食管黏膜长期暴露于胃食管反流导致鳞状上皮被化生的（肠化的）柱状上皮所取代。这种易发生癌变的上皮成为“癌症发生的沃土”，进一步发生上皮内瘤变（intra-epithelialneoplasia，IEN）和Barrett相关EAC（图1）。
一些流行病学研究证实Barrett食管患者发生EAC的风险增加30～125倍。然而，只有小部分Barrett食管患者发生EAC，并且指南推荐对Barrett食管患者进行常规的内镜监测。这种肿瘤二级预防策略昂贵、有创，且依从性和可行性不佳具有局限性。此外，组织学诊断的异型增生仍然是识别Barrett食管患者具有癌变风险的唯一有效标志，然而这一过程所需的时间却无法预测，Barret食管癌变的分子机制仍不清楚。因此，找到可以用于EAC二级预防的便宜、有效的（分子）生物学标志是当前的热点。
这一尝试受限于Barrett食管复杂的遗传背景，涉及到多种遗传学、表观遗传学和转录后改变。此外，对Barrett食管相关病变的定义（如化生性病变的分类，IEN的分级）在不同的观测者之间也有明显的差异，而只有使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的标本才能进行充分的组织学分类。但目前的FFPE制备方法不适用于许多下游的分子生物学技术，进一步影响了这一领域分子生物学研究的可靠性。事实上，只是到了近期，随着诸如靶向二代测序等“FFPE友好”新技术的出现，才开始对胃肠道恶性病变癌变的分子机制有了准确全面的了解。
本综述总结了目前关于食管黏膜癌变的最新观念和最重要的分子机制。Barrett黏膜发生的分子背景食管黏膜的化生现象在病因学上与慢性胃食管反流病关联。关于反流物中两种主要的毒性物质：酸和胆盐对鳞状上皮的致病作用，已经在体内和体外进行了众多研究。在长期暴露于胃食管反流之后首先观察到的分子改变是鳞状上皮CDX 基因的显著上调。这些基因在生理学上与单层柱状上皮的形成直接相关。事实上，CDX2在小肠和大肠均高表达，而在正常的食管黏膜不表达。在反流性食管炎和Barrett食管的动物模型中，反流损伤的食管鳞状上皮CDX2表达的增加先于食管肠上皮化生的出现。类似的，在存在炎症的食管鳞状上皮活检标本中，人类CDX2的表达也增加，并且先于其他肠化标志物如MUC2、蔗糖酶-异麦芽糖酶、防御素-5和碱性磷酸酶的表达。这些研究提示CDX2的过表达可能参与到食管黏膜表型转换的早期过程中。
一些研究发现，hedgehog信号传导通路的激活是食管黏膜暴露于胃酸和胆盐后的另一个特征性早期分子事件。特别值得注意的是，研究发现在Barrett黏膜（Barrett's mucosa ，BM） 样本中Snoichedgehog（SHH）显著上调。有趣的是，SHH在胚胎期的食管中表达，在成人食管的鳞状上皮中未表达。在发炎的食管黏膜中，SHH的过表达使得食管固有层间充质细胞中骨形态发生蛋白-4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）表达上调。BMP4是SHH的下游靶点，也是肿瘤生长因子β（tumor growth factor β，TGFβ）信号通路的成员。而BMP4信号又反过来以旁分泌的形式对上皮细胞起作用，包括引起转录因子SOX9的过表达，后者促进柱状上皮的发生。在BM中SHH-BMP4-SOX9轴的激活已经被很多体内和体外实验所证实。
Notch信号通路是形态发生信号通路，参与正常肠上皮的分化和Barrett食管中的肠上皮化生。此外，Notch信号通路还调节贲门祖细胞的分化，与食管上皮的恶性转化相关。
炎症在Barrett黏膜进展为癌前病变和肿瘤性病变中的作用在人类病理学很多领域都广泛证实了长期炎症导致肿瘤发生的潜能。长期暴露于胃食管反流物中会触发损伤的食管细胞释放炎症细胞因子和趋化因子，激活炎症细胞的迁移。此后，迁移来的炎症细胞所产生的细胞因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）在EAC发生中起到了至关重要的作用。ROS和RNS都可以导致DNA损伤，这是Barrett食管癌变的标志。已有研究报道染色体不稳定和拷贝数变异是BM及其癌变过程中的早期事件。
另一方面，促炎症细胞因子参与血管生成、组织重构和肿瘤细胞增生；核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）和白介素6（IL-6）/信号转导和转录激活蛋白3（STAT3）通路是了解最透彻的两条与BM癌变相关的炎症信号通路。研究发现在BM和EAC标本中NF-κB上调，后者调节许多促炎症因子和包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在内的生长调节因子的表达。值得注意的是，随着化生-异型增生-癌变的过程进展，TNF-α的表达增加，通过β-链蛋白介导的通路导致原癌基因MYC 增加。
在BM发展至IEN及EAC的过程中，IL-6/STAT3通路激活。与正常组织相比，BM中IL-6水平增加，而与没有异型增生的BM标本相比，高级别IEN病变中IL-6水平更高。此外，在IEN和EAC组织中还观测到STAT3磷酸化水平的增加。Barrett食管癌变过程中关键的抑癌基因和癌基因一些研究发现Barrett食管进展至EAC的过程是抑癌基因和癌基因遗传性或表观遗传学改变积累的结果。在BM早期经常能观测到的细胞周期失调主要由于两个抑癌基因CDKN2A（p16）和TP53 （p53）失活引起的。
P16通过抑制细胞周期蛋白依赖型激酶（CDK4/CDK6）介导的视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化来调节G1到S期细胞周期转化。尽管在EAC患者中CDKN2A 基因点突变少见（约5%），但CDKN2A 杂合子缺失（loss of heterozygosity，LOH）或启动子过甲基化（即基因沉默）见于80%的Barrett食管患者。三个各自独立的研究证明CDKN2A 启动子甲基化（伴或不伴CDKN2A -LOH）是BM癌变过程中CDKN2A 失活的常见机制。值得注意的是，在无异型增生的BM和低级别IEN中，CDKN2A 启动子甲基化被证明是进展至高级别IEN和EAC的独立危险因素。此外，p16失调还与以下环节相关：① 细胞周期蛋白D1显著过表达（常见于Barrett食管癌变的过程）；② 发生EAC的风险增加；③ IEN的分级。
食管黏膜转化的另一个标志是TP53 抑癌基因失活。导致食管黏膜TP53 完全失活最常见的联合事件是一个等位基因突变合并另一个等位基因缺失。TP53 是晚期事件，是高级别IEN的特征。事实上，许多独立的研究证明TP53 基因LOH的比例随着IEN组织学分级的提高显著增大。TP53 基因突变导致突变的p53蛋白失去稳定性，这一点可以通过免疫组化证实。因此，p53免疫染色可作为一种有效的诊断工具，在临床上用于评估Barrett食管相关的IEN病变。p53染色模式随着Barrett食管的进展而改变，在低级别IEN中呈中低强度，而在高级别IEN和EAC中呈弥漫的高强度染色。然而，由于并非所有的p53突变都导致突变蛋白的不稳定，免疫组化染色在LOH分析上不如DNA测序敏感。
此外，转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）在Barrett食管进展过程中细胞周期失控中也起到重要作用。在正常细胞中，TGFβ引起可逆的细胞周期停滞，而许多上皮肿瘤对这一信号无反应。在肿瘤细胞中，TGFβ参与上皮细胞间质转化（epithelial tomesenchymal Transition，EMT），特别是在肿瘤侵袭的边界，这种表型改变被认为有助于肿瘤侵袭和转移。
这两种机制都参与到Barrett食管向EAC进展的过程中。在EAC患者中，TGFβ表达上调，超过正常食管鳞状上皮和Barrett食管，并且与进展期肿瘤相关。BM中TGFβ信号通路失调的一个重要机制是调控下游转录调节因子，特别是SMAD2 和SMAD4 。SMAD2 和SMAD4 所在的染色体18q的LOH在EAC患者中相对常见。SMAD4 mRNA的表达在化生-异型增生-癌变的过程中进行性减少，在大约70%的原发Barrett食管相关EAC中可发现SMAD4启动子甲基化。
在Barrett食管癌变过程中，一些癌基因扩增/过表达是相对常见的现象，尤其是上皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）家族成员。在2/3的EAC患者中EGFR蛋白表达增加，并与更高的肿瘤分期相关。HER2 扩增仅见于IEN和EAC病变，已经作为靶点成功地用于治疗进展期胃-食管癌。Barrett食管新的标志物：非编码RNA的作用在肿瘤学的研究中，非编RNA（ncRNAs）备受关注。在众多家族中，小RNA（miRNA）失调在人类肿瘤发生中的作用得到了最广泛的研究。miRNA被认为是一类新的生物标志物，它们体积很小，在生物样本中可以保持稳定，能够调节上百种信RNA（mRNA），与mRNA相比，它们的总数相对较少。全面研究miRNA表达谱发现，miRNA涉及Barrett食管癌变的每一步。miR-21在高级别IEN和EAC中均上调。miR-21被认为是肿瘤miR，因为它的靶点是一些抑癌基因，如PTEN ，PDCD4 ，RECK 和TPM1 。
两个研究报道了Barrett食管癌变过程中miR-196a显著上调。值得注意的是，在食管上皮癌变的过程中，miR-196a的靶点ANXA1、SPRR2C和S100A9表达下降甚至缺失。
此外，研究发现，在Barrett食管癌变的过程中，位于染色体7q22.1的miR-106b-25多顺反子（即miR-25、miR-93和miR-106b）活性增加，这些miR在体外有潜在的促进增生、抗凋亡和调节细胞周期的作用，在体内则以p21和
最近的研究证明，可以依照四种miRNA（miR-192，miR-194，miR-196a和miR-196b）的表达谱，将Barrett食管患者按照5年内疾病进展的风险分层。除了miRNA以外，其他重要的ncRNA代表了超保守区域（ultraconserved regions，UCRs）。UCRs发现于2004年，是通过生物信息学方法比较大鼠、小鼠和人类这三种脊椎动物的基因组所发现的完全保守（100%一致，没有插入或缺失）的区域。相当一部分UCRs在正常人类组织中被转录（transcribed UCRs，T-UCRs），已经证实它们在人类癌症中失调。
近期研究了Barrett食管癌变过程中T-UCRs的表达谱。发现在人类和两个鼠类Barrett食管癌变模型中，类似的表达谱有类似的组织学病变，这提示T-UCRs可以作为Barrett食管相关病变生物学行为新的诊断和预后工具。
小 结
点评（王晔 北京大学第三医院消化科）：
引 言
在最近20年内，食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）已经成为西方人群中最致命的肿瘤。EAC的发病率显著增加，而预后却依旧十分差，总的5年生存率低于20%。这主要是由于大部分患者就诊时局部肿瘤处于进展期或已有远处转移，此时现存治疗措施基本无效。因此，早期诊断EAC会显著改善患者的总体生存率。
Barrett食管是EAC最重要的癌前病变，这一点已经得到广泛的证明。Barrett食管是食管黏膜长期暴露于胃食管反流导致鳞状上皮被化生的（肠化的）柱状上皮所取代。这种易发生癌变的上皮成为“癌症发生的沃土”，进一步发生上皮内瘤变（intra-epithelialneoplasia，IEN）和Barrett相关EAC（图1）。
一些流行病学研究证实Barrett食管患者发生EAC的风险增加30～125倍。然而，只有小部分Barrett食管患者发生EAC，并且指南推荐对Barrett食管患者进行常规的内镜监测。这种肿瘤二级预防策略昂贵、有创，且依从性和可行性不佳具有局限性。此外，组织学诊断的异型增生仍然是识别Barrett食管患者具有癌变风险的唯一有效标志，然而这一过程所需的时间却无法预测，Barret食管癌变的分子机制仍不清楚。因此，找到可以用于EAC二级预防的便宜、有效的（分子）生物学标志是当前的热点。
这一尝试受限于Barrett食管复杂的遗传背景，涉及到多种遗传学、表观遗传学和转录后改变。此外，对Barrett食管相关病变的定义（如化生性病变的分类，IEN的分级）在不同的观测者之间也有明显的差异，而只有使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的标本才能进行充分的组织学分类。但目前的FFPE制备方法不适用于许多下游的分子生物学技术，进一步影响了这一领域分子生物学研究的可靠性。事实上，只是到了近期，随着诸如靶向二代测序等“FFPE友好”新技术的出现，才开始对胃肠道恶性病变癌变的分子机制有了准确全面的了解。
本综述总结了目前关于食管黏膜癌变的最新观念和最重要的分子机制。Barrett黏膜发生的分子背景食管黏膜的化生现象在病因学上与慢性胃食管反流病关联。关于反流物中两种主要的毒性物质：酸和胆盐对鳞状上皮的致病作用，已经在体内和体外进行了众多研究。在长期暴露于胃食管反流之后首先观察到的分子改变是鳞状上皮CDX 基因的显著上调。这些基因在生理学上与单层柱状上皮的形成直接相关。事实上，CDX2在小肠和大肠均高表达，而在正常的食管黏膜不表达。在反流性食管炎和Barrett食管的动物模型中，反流损伤的食管鳞状上皮CDX2表达的增加先于食管肠上皮化生的出现。类似的，在存在炎症的食管鳞状上皮活检标本中，人类CDX2的表达也增加，并且先于其他肠化标志物如MUC2、蔗糖酶-异麦芽糖酶、防御素-5和碱性磷酸酶的表达。这些研究提示CDX2的过表达可能参与到食管黏膜表型转换的早期过程中。
一些研究发现，hedgehog信号传导通路的激活是食管黏膜暴露于胃酸和胆盐后的另一个特征性早期分子事件。特别值得注意的是，研究发现在Barrett黏膜（Barrett's mucosa ，BM） 样本中Snoichedgehog（SHH）显著上调。有趣的是，SHH在胚胎期的食管中表达，在成人食管的鳞状上皮中未表达。在发炎的食管黏膜中，SHH的过表达使得食管固有层间充质细胞中骨形态发生蛋白-4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）表达上调。BMP4是SHH的下游靶点，也是肿瘤生长因子β（tumor growth factor β，TGFβ）信号通路的成员。而BMP4信号又反过来以旁分泌的形式对上皮细胞起作用，包括引起转录因子SOX9的过表达，后者促进柱状上皮的发生。在BM中SHH-BMP4-SOX9轴的激活已经被很多体内和体外实验所证实。
Notch信号通路是形态发生信号通路，参与正常肠上皮的分化和Barrett食管中的肠上皮化生。此外，Notch信号通路还调节贲门祖细胞的分化，与食管上皮的恶性转化相关。
炎症在Barrett黏膜进展为癌前病变和肿瘤性病变中的作用在人类病理学很多领域都广泛证实了长期炎症导致肿瘤发生的潜能。长期暴露于胃食管反流物中会触发损伤的食管细胞释放炎症细胞因子和趋化因子，激活炎症细胞的迁移。此后，迁移来的炎症细胞所产生的细胞因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）在EAC发生中起到了至关重要的作用。ROS和RNS都可以导致DNA损伤，这是Barrett食管癌变的标志。已有研究报道染色体不稳定和拷贝数变异是BM及其癌变过程中的早期事件。
另一方面，促炎症细胞因子参与血管生成、组织重构和肿瘤细胞增生；核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）和白介素6（IL-6）/信号转导和转录激活蛋白3（STAT3）通路是了解最透彻的两条与BM癌变相关的炎症信号通路。研究发现在BM和EAC标本中NF-κB上调，后者调节许多促炎症因子和包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在内的生长调节因子的表达。值得注意的是，随着化生-异型增生-癌变的过程进展，TNF-α的表达增加，通过β-链蛋白介导的通路导致原癌基因MYC 增加。
在BM发展至IEN及EAC的过程中，IL-6/STAT3通路激活。与正常组织相比，BM中IL-6水平增加，而与没有异型增生的BM标本相比，高级别IEN病变中IL-6水平更高。此外，在IEN和EAC组织中还观测到STAT3磷酸化水平的增加。Barrett食管癌变过程中关键的抑癌基因和癌基因一些研究发现Barrett食管进展至EAC的过程是抑癌基因和癌基因遗传性或表观遗传学改变积累的结果。在BM早期经常能观测到的细胞周期失调主要由于两个抑癌基因CDKN2A（p16）和TP53 （p53）失活引起的。
P16通过抑制细胞周期蛋白依赖型激酶（CDK4/CDK6）介导的视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化来调节G1到S期细胞周期转化。尽管在EAC患者中CDKN2A 基因点突变少见（约5%），但CDKN2A 杂合子缺失（loss of heterozygosity，LOH）或启动子过甲基化（即基因沉默）见于80%的Barrett食管患者。三个各自独立的研究证明CDKN2A 启动子甲基化（伴或不伴CDKN2A -LOH）是BM癌变过程中CDKN2A 失活的常见机制。值得注意的是，在无异型增生的BM和低级别IEN中，CDKN2A 启动子甲基化被证明是进展至高级别IEN和EAC的独立危险因素。此外，p16失调还与以下环节相关：① 细胞周期蛋白D1显著过表达（常见于Barrett食管癌变的过程）；② 发生EAC的风险增加；③ IEN的分级。
食管黏膜转化的另一个标志是TP53 抑癌基因失活。导致食管黏膜TP53 完全失活最常见的联合事件是一个等位基因突变合并另一个等位基因缺失。TP53 是晚期事件，是高级别IEN的特征。事实上，许多独立的研究证明TP53 基因LOH的比例随着IEN组织学分级的提高显著增大。TP53 基因突变导致突变的p53蛋白失去稳定性，这一点可以通过免疫组化证实。因此，p53免疫染色可作为一种有效的诊断工具，在临床上用于评估Barrett食管相关的IEN病变。p53染色模式随着Barrett食管的进展而改变，在低级别IEN中呈中低强度，而在高级别IEN和EAC中呈弥漫的高强度染色。然而，由于并非所有的p53突变都导致突变蛋白的不稳定，免疫组化染色在LOH分析上不如DNA测序敏感。
此外，转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）在Barrett食管进展过程中细胞周期失控中也起到重要作用。在正常细胞中，TGFβ引起可逆的细胞周期停滞，而许多上皮肿瘤对这一信号无反应。在肿瘤细胞中，TGFβ参与上皮细胞间质转化（epithelial tomesenchymal Transition，EMT），特别是在肿瘤侵袭的边界，这种表型改变被认为有助于肿瘤侵袭和转移。
这两种机制都参与到Barrett食管向EAC进展的过程中。在EAC患者中，TGFβ表达上调，超过正常食管鳞状上皮和Barrett食管，并且与进展期肿瘤相关。BM中TGFβ信号通路失调的一个重要机制是调控下游转录调节因子，特别是SMAD2 和SMAD4 。SMAD2 和SMAD4 所在的染色体18q的LOH在EAC患者中相对常见。SMAD4 mRNA的表达在化生-异型增生-癌变的过程中进行性减少，在大约70%的原发Barrett食管相关EAC中可发现SMAD4启动子甲基化。
在Barrett食管癌变过程中，一些癌基因扩增/过表达是相对常见的现象，尤其是上皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）家族成员。在2/3的EAC患者中EGFR蛋白表达增加，并与更高的肿瘤分期相关。HER2 扩增仅见于IEN和EAC病变，已经作为靶点成功地用于治疗进展期胃-食管癌。Barrett食管新的标志物：非编码RNA的作用在肿瘤学的研究中，非编RNA（ncRNAs）备受关注。在众多家族中，小RNA（miRNA）失调在人类肿瘤发生中的作用得到了最广泛的研究。miRNA被认为是一类新的生物标志物，它们体积很小，在生物样本中可以保持稳定，能够调节上百种信RNA（mRNA），与mRNA相比，它们的总数相对较少。全面研究miRNA表达谱发现，miRNA涉及Barrett食管癌变的每一步。miR-21在高级别IEN和EAC中均上调。miR-21被认为是肿瘤miR，因为它的靶点是一些抑癌基因，如PTEN ，PDCD4 ，RECK 和TPM1 。
两个研究报道了Barrett食管癌变过程中miR-196a显著上调。值得注意的是，在食管上皮癌变的过程中，miR-196a的靶点ANXA1、SPRR2C和S100A9表达下降甚至缺失。
此外，研究发现，在Barrett食管癌变的过程中，位于染色体7q22.1的miR-106b-25多顺反子（即miR-25、miR-93和miR-106b）活性增加，这些miR在体外有潜在的促进增生、抗凋亡和调节细胞周期的作用，在体内则以p21和
Bim为靶点具有致癌作用。
最近的研究证明，可以依照四种miRNA（miR-192，miR-194，miR-196a和miR-196b）的表达谱，将Barrett食管患者按照5年内疾病进展的风险分层。除了miRNA以外，其他重要的ncRNA代表了超保守区域（ultraconserved regions，UCRs）。UCRs发现于2004年，是通过生物信息学方法比较大鼠、小鼠和人类这三种脊椎动物的基因组所发现的完全保守（100%一致，没有插入或缺失）的区域。相当一部分UCRs在正常人类组织中被转录（transcribed UCRs，T-UCRs），已经证实它们在人类癌症中失调。
近期研究了Barrett食管癌变过程中T-UCRs的表达谱。发现在人类和两个鼠类Barrett食管癌变模型中，类似的表达谱有类似的组织学病变，这提示T-UCRs可以作为Barrett食管相关病变生物学行为新的诊断和预后工具。
小 结
Barrett食管的癌变过程表现为一系列的形态学改变，最终进展至食管腺癌。尽管从正常食管鳞状上皮进展至食管腺癌的形态学过程已经了解得很透彻，但对其分子学标志尚未明确。很大程度上影响了基于生物学行为的EAC二级预防。新技术的出现（二代测序技术、高通量微阵列技术）和偶然发现的新一类生物标志物（如ncRNAs）将有助于准确和全面地理解Barrett食管癌前病变和癌变的分子特征。
从Barrett食管到食管腺癌的癌变过程中的一系列组织病理学改变已经很明确，但其背后的分子机制仍不十分清楚。本文综述了这一癌变过程中所涉及的信号通路、关键的抑癌基因和癌基因以及慢性炎症在其中所起的作用，同时还探讨了非编码RNA等新的生物标志物在发病中所起的作用，为未来的研究提出了方向。
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